Density Functional Theory Applied to Copper Proteins

Samenvatting

Bij scheikundig onderzoek wordt al snel gedacht aan laboratoria met allerlei pruttelende kolfjes en reageerbuisjes, vervuiling door chemische stoffen en dergelijke stereotypes. Een reëel beeld van de werkelijkheid is het echter niet helemaal. Weliswaar wordt een groot deel van het huidige onderzoek nog gedaan op voorgenoemde experimentele wijze, maar een "nieuwe" trend binnen chemisch onderzoek is de toepassing van schone chemie, namelijk met behulp van berekeningen.

Heel erg nieuw is deze manier van onderzoek doen niet, de beginselen (van de zogenaamde kwantumchemie) werden immers al in het begin van de 20ste eeuw geformuleerd. Lange tijd echter was de toepassing van kwantumchemie beperkt tot relatief kleine moleculen, maar door de steeds krachtiger en sneller wordende computers is het in de laatste jaren ook mogelijk om grote (bio-) systemen aan te pakken. Vooral de beschrijving van metaaleiwitten met behulp van berekeningen is de laatste jaren enorm in opmars.

Onderzoek naar metaaleiwitten is van belang aangezien ze verschillende elementaire processen regelen binnen het menselijk lichaam, alsmede in het planten en dierenrijk. Door de toepassing van metaalatomen in eiwitten kunnen deze processen uitgevoerd worden onder "lichaams-eigen" omstandigheden. Kopereiwitten hebben binnen de complexe chemie in onder andere het menselijk lichaam vaak de rol van elektronenoverdrachtseiwitten; dat wil zeggen dat op de ene plek een elektron wordt opgenomen, waarna het eiwit naar een andere plek gaat en daar het elektron weer afgeeft. Het gebruik van koper hiervoor is "natuurlijk" aangezien het zowel in de mono-valente vorm (Cu^I) als in de di-valente vorm (Cu^II) een sterke binding heeft met het eiwit, wat gepaard gaat met een grote stabiliteit. Daarnaast is het vaak zo dat het eiwit het koperatoom in een bepaalde conformatie dwingt, die het midden houdt tussen de mono- en di-valente voorkeursconformatie. Dit vergemakkelijkt de elektronenoverdracht waardoor het eiwit zijn functie nog efficiënter kan uitvoeren.

De toepassing van kwantumchemie op metaaleiwitten vertoont dezelfde opmars als het gebruik van DFT (Density Functional Theory) binnen chemisch onderzoek. Tot een aantal jaren geleden waren voorbeelden van beide relatief gezien schaars, maar door de ontwikkelingen op het gebied van DFT (zoals de ontwikkeling van betere [GGA] potentialen, efficiëntere programmatuur onder andere door parallel computing technieken) is het tegenwoordig bijna standaard om DFT berekeningen te gebruiken in onderzoek.

Toch blijven biosystemen als (metaal-)eiwitten te groot om volledig te worden beschreven met kwantumchemie. Daarnaast wordt er een gedetailleerde methode gebruikt voor grote delen van het systeem waar een minder nauwkeurige beschrijving (met behulp van speciaal ontwikkelde force fields) meer dan voldoende is om de relevante processen goed te kunnen beschrijven. Voor de dynamische eigenschappen blijken deze force fields vaak een zeer goede beschrijving te geven, tenzij er een metaalatoom aanwezig is in het eiwit. De interacties van een metaalatoom met het eiwit blijken namelijk moeilijk te generaliseren in een algemeen toepasbaar force field. De ontwikkeling van een force field specifiek voor een bepaald (type) eiwit was een van de doelen van het onderzoek beschreven in dit proefschrift.

Kopereiwitten worden ingedeeld in diverse types, naar gelang hun structurele en spectroscopische eigenschappen. Type 2 kopereiwitten vertonen electronparamagnetische spectra die gelijk zijn aan die van "normale" koper-complexen, type 3 kopereiwitten vertonen helemaal geen paramagnetische activiteit, terwijl type 1 kopereiwitten gekarakteriseerd worden door een felblauwe kleur. Daarom worden ze in de regel blauwe kopereiwitten genoemd. Het eiwit dat werd bestudeerd in dit proefschrift is azurine, een type 1 kopereiwit, dat waarschijnlijk elektronenoverdracht als functie heeft en dat bestaat uit 128 (Pseudomonas aeruginosa) of 129 (Alcaligenes denitrificans) aminozuren. Net als alle andere type 1 kopereiwitten is het koperatoom in het actieve centrum gebonden aan drie sterke liganden (twee histidine en een cysteine aminozuurzijketens) die ongeveer in één vlak liggen met het koperatoom. Daarnaast zijn er twee axiale aminozuurresiduen (glycine en methionine), die gecoördineerd zijn met het koperatoom. Het glycineresidu is speciaal in dit opzicht aangezien azurine het enige type 1 kopereiwit is waar dit residu coördineert met de koper.

Een aantal methodes werd ontwikkeld om de benodigde force field parameters voor deze kopereiwitten te halen uit DFT gegevens. De eerste methode (MDC ladingsanalyse) levert atomaire ladingen op die representatief zijn voor het bestudeerde systeem: de meest relevante moleculaire en atomaire eigenschappen (multipolen) voor de bepaling van de Coulomb potentiaal worden exact gerepresenteerd. De tweede methode (IntraFF) haalt uit de berekende (Hessian) matrix met de tweede afgeleiden van de energie naar de atomaire coördinaten, waardes voor krachtsconstanten die gebruikt kunnen worden in force field berekeningen cq. simulaties voor interacties waarvoor geen standaardwaarde beschikbaar is.

Als eerste werden echter een aantal eigenschappen van het gebruik van DFT vastgesteld, met name de nauwkeurigheid van de voorspelde waardes van moleculaire polariseerbaarheden, geometrieën van moleculen, alsmede een vergelijking van de nieuw ontwikkelde ll adingsanalyse met andere methodes. Uit deze resultaten blijkt dat DFT zeer nauwkeurig de geometrie of polariseerbaarheid van of ladingsverdeling binnen een molecuul kan voorspellen, met een nauwkeurigheid en efficiëntie die moeilijk te bereiken is met andere kwantumchemische methodes.

Daarnaast werd DFT gebruikt om het voorgestelde mechanisme van twee reacties te toetsen. De eerste bestudeerde reactie is afkomstig uit de organische chemie, waarbij een zinkatoom betrokken is. De verschillende invloeden van een aminoalcohol of een aminothiol op de asymmetrische additie van dialkylzinkmoleculen aan aldehyde werden onderzocht, waarbij de enantiomere selectiviteit alsmede de versnellende invloed van de katalysator verklaard kunnen worden met behulp van de berekende resultaten. De tweede reactie gaat al meer richting het einddoel van het promotie-onderzoek, aangezien daarin een enzym werd bestudeerd dat een koperatoom bevat in het actieve centrum. De verschillende stadia die leiden van de complexatie van het substraat naar productvorming werden bestudeerd, waarbij een aantal belangrijke intermediairen gelokaliseerd werden.

Hiermee komen we dan bij de studies aan kopereiwitten, waarbij het azurine eiwit bekeken werd in zijn natuurlijke (wildtype) vorm, alsmede in een aantal andere vormen waarbij er verschillende aminozuren vervangen zijn door andere. De invloed van deze vervangingen (mutaties) op relevante eigenschappen van het eiwit is experimenteel uitgebreid getest, wat een uitstekend referentiekader biedt om de berekeningen aan te toetsen. De ladingsverdeling in het actieve centrum van azurine (zowel wildtype als een aantal mutaties ervan) blijkt een coherente structuur te hebben: de manier waarop de elektronen verdeeld zijn binnen het actieve centrum varieert nauwelijks als men kijkt naar de verschillende azurinemoleculen; in alle gevallen is de totale lading op koper een stuk lager dan zijn formele lading, terwijl er een grote mate van delokalisatie is over de drie histidine en cysteine liganden, alsmede over de axiale methionine groep. Dit suggereert een functie als ligand ook voor methionine, terwijl glycine beter omschreven kan worden als coördinerende groep.

Naast het bestuderen van de ladingsverdeling van het actieve centrum werden ook krachtsconstanten bepaald voor de bindingen tussen koper en de vijf aminozuren in het actieve centrum. De waardes hiervoor blijken sterk afhankelijk te zijn van de gebruikte geometrie van het centrum, wat een direct gevolg is van het anharmonische verloop van de binding. Aangezien de geometrie direct overgenomen is van de experimenteel bepaalde kristalstructuur met bijbehorende onnauwkeurigheid van 0.1-0.2 Angstrom, moeten de harmonische force field parameters zorgvuldig bekeken worden. Beter zou het dan zijn om de anharmonische parameters, die ook geleverd worden door de IntraFF methode, te gebruiken. Evenwel, een moleculaire dynamica simulatie aan wildtype azurine met de harmonische IntraFF parameters en de MDC ladingen levert een stabiel actief centrum en eiwit op in de simulatie, met koper-ligand afstanden die overeenkomen met experimentele gegevens en vibratiefrequenties voor de koper-ligandbindingen die in het juiste bereik van 200-500 cm^-1 liggen.

Metaaleiwitten worden vaak gekarakteriseerd met behulp van UV/VIS en EPR/ESR spectroscopie. De spectra van de eiwitten kunnen daarom dienen als referentiemateriaal om de berekende karakteristieken mee te vergelijken. In het geval van EPR-spectroscopie gaat het dan om de zogenaamde g-tensor, die bepaald wordt door een ongepaard elektron. Het gebruik van DFT om deze tensor te berekenen blijkt voor systemen met metaalatomen soms problematisch, met een onderschatting van de z-waarde van de tensor tot 50%. Ook de voorspelling van de hyperfijnkoppelingstensor van koper is soms matig, met z-waardes die tot drie keer te groot zijn. Daarentegen worden de hyperfijnkoppelingstensoren van andere atomen vaak redelijk goed beschreven, zeker in het geval van de kopereiwitten waar de verschillen tussen de twee histidine residuen in het actieve centrum goed voorspeld worden.

De UV/VIS spectra (of excitatie-energieën) van kopereiwitten kunnen met DFT alleen berekend worden voor de gereduceerde toee stand (met koper formeel in zijn +1 redox toestand), en niet voor de geoxideerde toestand (formele redox toestand +2). Daarom werden de UV/VIS spectra voorspeld met semi-empirische CNDO/INDO berekeningen, zowel voor het actieve centrum alleen als het actieve centrum in de omgeving van het eiwit en oplosmiddel. Hierbij bleek de aanwezigheid van de omgeving een beslissende rol te spelen voor de berekende excitatie-energieën. De parameters voor koper in de gereduceerde toestand werden hierbij verkregen door de berekende semi-empirische excitatie-energieën te fitten aan de berekende DFT energieën.

Om niet afhankelijk te zijn van de kristalstructuur met de bijbehorende onnauwkeurigheid van 0.1-0.2 Angstrom, en om de invloed van de eiwitomgeving op de geometrie van het actieve centrum te bepalen, werden QM/MM berekeningen uitgevoerd. In deze berekeningen werd het hele eiwit (inclusief een schil van watermoleculen rondom) meegenomen in de berekening, waarbij het actieve centrum werd beschouwd met DFT (QM systeem) en de rest van het eiwit (en oplosmiddelmoleculen) met een klassiek force field (MM systeem), dat gespecialiseerd is voor het beschrijven van biosystemen zoals eiwitten. Een nieuw model (AddRemove) voor de directe koppeling van de QM en MM systemen werd daarvoor ontwikkeld, waarin in de DFT berekening waterstofatomen worden toegevoegd aan het actieve centrum om de valentie van het QM systeem te waarborgen. Achteraf worden de interacties van de toegevoegde waterstoffen met de echte QM atomen gecorrigeerd, zodat in principe de artificiele toevoeging van de waterstoffen geen effect heeft op de geometrie en/of energie.

De geometrie van een aantal azurinemoleculen (wildtype, gemuteerd en metaalgesubstitueerd) werd met QM/MM geoptimaliseerd, waarbij het aantal atomen varieerde van ca. 2200 tot 14.000, afhankelijk van het aantal watermoleculen dat meegenomen werd in de berekening. De geoptimaliseerde geometrie van het actieve centrum vertoont over het algemeen een grote gelijkenis met experimenteel bepaalde structuren (ofwel kristalstructuur of EXAFS). De enige echte discrepantie treedt op voor de gereduceerde toestand van de Met121Gln azurine-mutant, die in berekeningen vrijwel identiek is aan de gereduceerde wildtype azurinestructuur, maar die qua kristalstructuur een behoorlijke vervorming vertoont. De afwijking is dermate groot, en voor de rest de overeenkomst tussen berekende en experimentele structuur ook, dat het niet te verwachten is dat er iets mis is met de berekeningen. Het lijkt er eerder op dat er een ander (onverwacht) effect een rol speelt.